1、简述
1.1.微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一。
2. 设备要求
2.1.微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统，应在洁净度100级的单向流空气区域内进行，其环境的洁.净度为10000级。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
2.2. 阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。
3. 取样
3.1. 在各取水口用已灭菌好的封闭的250ml 空三角瓶取水，并将瓶子做上标记或贴上标签，标明日期和取样点名称。
3.2. 取样前洗手并消毒。
3.3. 将取样阀消毒。
3.4. 打开阀门，放水3~5分钟。
3.5. 已灭菌好的封闭的空三角瓶在取水前用75％的酒精棉球擦拭外壁。
3.6. 用待检测的水淋洗检验用取样瓶和瓶塞3次，每取样点取2瓶,共约1000ml。
3.7. 微生物检验应在取样后的1h内进行，否则将样品冷藏并在4h内进行检验。
3.8. 待检验的水在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
4. 试验准备
4.1. 将供试品及所有已灭菌的玻璃器皿经传递窗移至无菌室内。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
4.2. 开启紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
4.3. 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘状棉球（也可用乙醇棉球）擦试供试品瓶的开口处周围，待干后启封。
5. 细菌、霉菌计数
5.1. 纯化水和注射用水均采用薄膜过滤法计数。
5.2. 取滤膜孔径不大于0.45μm，直径不小于50mm可拆卸的滤器。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。
5.3. 过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总滤膜不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
5.4. 纯化水每张滤膜取相当于1ml的水直接过滤；注射用水取至少200ml。用PH7.0无菌氯化纳－蛋白胨缓冲液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。
6. 培养和计数
6.1. 一般细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养48h。霉菌计数平板倒置于20～25℃培养箱中培养72h。
6.2. 除另有规定外，细菌培养48小时，分别在24及48小时点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌培养72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
6.3. 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界限时，一条链，片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链（片）状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。
6.4. 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
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